422章分克隆
三级文明，关克隆，已经研究分水平，分克隆！
什分克隆呢？
分水平提供纯化扩增特定dna片段方法。常含目基因，体外重组方法将它插入克隆载体，形重组克隆载体，通转化与转导方式，引入适合寄主体内复制与扩增，再筛选寄主细胞内分离提纯需克隆载体，插入dna许拷贝，获目基因扩增。
分克隆指分离已知dna序列，并in vivo(**内)方式获许复制品程。复制程经常被增加并获取dna片段基因，增加某任dna序列，启、非编码序列、化合寡核苷酸或随机dna片断。
将dna片段(或基因)与载体dna分共价连接，引入寄主细胞，再筛选获重组克隆，按克隆目分dnacdna克隆两类。
cdna克隆mrna原材料，经体外反转录合互补dna(cdna)，再与载体dna分连接引入寄主细胞。每cdna反映mrna结构，cdna克隆分布反映mrna分布。特:
物，rna病毒dna，cdna克隆;
cdna克隆易筛选。因cdna库包含非结构基因克隆，且每cdna克隆含mrna信息;
cdna细菌表达。cdna仅代表某育阶段表达遗传信息，基因文库才包含物完整遗传信息。
。何做呢？
首先dna片段制备！
常方法获dna片段:1限制性核酸内切酶将高分量dna切定dna片段;2物理方法(超声波)取dna随机片段;3已知蛋白质氨基酸顺序况，工方法合应基因片段;4mrna反转录产cdna。
其次载体dna选择，知，什质粒。
质粒细菌染色体外遗传因，dna呈环状，1-200千碱基(kb)。细胞游离超螺旋状存，很容易制备。质粒dna通转化引入寄主菌。细胞两状态。‘紧密型‘;二‘松弛型‘。此外应具分量，易转化，至选择标记特。质粒型载体般携带10kbdna片段。适构建原核物基因文库，cdna库次级克隆。
柯斯(cos)质粒类带噬菌体dna粘性末端顺序质粒dna分。噬菌体-质粒混合物。此类载体分容量，携带45kb外源dna片段。象般质粒携带片段dna，直接转化寄主菌。类载体常被构建高等物基因文库。
噬菌体dna。常λ噬菌体dna双链。长约49kb，约含50基因，其50%基因噬菌体长裂解寄主菌必需，分布噬菌体dna两端。间非必需区，进改造组建系列具特载体分。λ载体系统适构建真核物基因文库cdna库。
m13噬菌体独特载体系统，它侵袭具f基因肠杆菌，裂解寄主菌。m13dna(rf)寄主菌内双链环状分，象质粒主复制。制备方法质粒。寄主菌分泌含单链dnam13噬菌体，方便制备单链dna。dna顺序分析、定突变核酸杂交。
接dna载体连接。
dna分与载体分连接克隆程重环节，方法:1粘性末端连接，dna片段两端互补碱基顺序称粘性末端，限制性内切酶消化dna产相粘性末端。连接酶恢复原，限制性内切酶虽识别顺序，却产相末端。2平头末端连接，物理方法制备dna往往平头末端，酶产平头末端。平头dna片段某dna连接酶连接，连接效率粘性末端高;3聚寡核苷酸末端连接。4工接头分连接，平头dna片段末端加段工合、具某限制性内切酶识别位寡核苷酸片段，经限制性内切酶产粘性末端。
连接反应需注载体dna与dna片段比率。λ或cos质粒载体，形线性连体dna分，载体与dna片段比率高佳。质粒载体，形环状分，比率常1∶1。
引入寄主细胞。
常两方法:1转化或转染，方法将重组质粒dna或噬菌体dna(m13)与氯化钙处理宿主细胞混合置冰，待dna被吸收铺平板培养基，再根据实验设计使选择性培养基筛选重组，通常重组分转化效率比非重组dna低，原因连接效率高，许dna分转化力，且重组dna分比原载体dna分，转化困难。2转导，病毒类侵染宿主菌程称转导，般转导效率比转化高。
此李安，操控墨莲。断收集材料，进研究。
三级文明，分克隆很！
分克隆技术展久。它应辟分遗传研究新领域，打类解、识别、分离改造基因，创造新物门。它工业、农牧业医产深远影响，并将解决世界临源、食品环保三危机拓条新路。
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利分克隆技术已将胰岛素，、牛鸡长激素、干扰素、松弛素、促红细胞长激素、乙型肝炎病毒抗原口蹄疫病毒抗原基因制工程菌，利酵工业进规模产。提高微物本身产蛋白酶类抗素类药物产量。
通遗传工程癌细胞具逆转正常细胞性，例sv40病毒引鼠肿瘤细胞。温度高逆转正常细胞。治疗半乳糖血症，带肠杆菌乳糖操纵λ噬菌体感染半乳糖血症患者离体培养细胞，细胞半乳糖苷酶达正常水平。并确实代谢半乳糖。
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植物遗传工程提高农物产量、培育新农物品提供。许外源基因导入植物获功。
关李安躯体正断形......
“顺反，，！身体变完！”
既建造身体，李安尽量让变完。
原核细胞，通常几mrna连，相互间由段短编码蛋白质间隔序列隔，mrna叫做顺反mrna。顺反概念遗传顺反重组试验，确定交换片段究竟基因内属两基因试验。简言，顺反基因。顺反基因。真核物顺反，比c.elegans共13500基因，约25%顺反。
mrna存原核真核物细胞质及真核细胞某细胞器(线粒体叶绿体)。rna病毒rna噬菌体rna既遗传信息载体具mrna功。物体mrna类少与物进化水平关，高等物含遗传信息，mrna类。物体内某mrna含量根据需，5龄蚕部丝腺体主任务快速合量丝蛋白，因编码丝蛋白mrna含量特别。细菌需断顺反适应外部环境，其体内编码某诱导酶mrna含量较。
原核真核物mrna特:1原核物mrna常顺反(见)形式存，即条mrna链编码几功相关联蛋白质。真核物mrna般单顺反形式存，即mrna编码蛋白质。2原核物mrna转录与翻译般偶联，即转录尚未完毕，蛋白质转译合已始。真核物转录mrna体则需经加工，加工熟mrna与蛋白质结合信息体才始，工信息体蛋白质与rna比约3。3原核物mrna半寿期很短，般几分钟，长数(rna噬菌体rna除外)。真核物mrna半寿期较长，胚胎mrna达数。4原核与真核物mrna结构特。
级结构与功关系:原核物mrna般5端段翻译区，称导顺序，3端段翻译区，间蛋白质编码区，般编码几蛋白质。肠杆菌乳糖操纵mrna编码3条肽链;色氨酸操纵mrna编码5条肽链。单顺反形式细菌mrna，肠杆菌脂蛋白mrna。原核物mrna分般修饰核苷酸，5端帽结构3端聚腺苷酸尾巴。原核物mrna始密码(aug)附近(5方向游)段长短等顺序，含较嘌呤核苷酸，被称sd顺序。(未完待续。。)